基因组工程

靶向基因组编辑依赖于我们在基因组特定位置诱导DNA双链断裂(DSB)的能力和修复模式。例如,在植物中,通过非同源端连接修复是容易出错的,并可能导致突变,通常被视为小的插入。如果同源DSB修复模板来源于传递的外源DNA,或者使用同源染色体进行修复时靶向基因转换或交叉,则同源重组修复可导致靶向基因替换(GT)。开发这些技术是我们对DSB修复感兴趣的结果。最近,定制设计的核酸酶,ZFNs, TALENs,特别是CRISPR-Cas的使用为植物的靶向突变打开了前景。在一项比较研究中,我们发现CRISPR-Cas是最有前途的技术,因为它设计简单、效率高。
有针对性的淘汰赛:我们已经在番茄中证明,CRISPR-Cas在靶向基因敲除中非常有效,在植物的早期发育阶段就已经产生了很高的突变率。它产生一些依赖于破损部位的优先修复脚印。
靶向交叉:我们正在利用同源重组修复某些断裂的事实,以诱导同源染色体之间的靶向交叉。
基因定位:我们已经证明,像RAD54或AtRAD52这样的蛋白过表达可以提高基因靶向率,但只是在有限的程度上。目前,我们正在利用病毒载体结合CRISPR-Cas DSB诱导来开发高效的植物基因靶向。
本文集成:基因组工程的一个有力工具是利用农杆菌衍生的T-DNA载体进行转化。目前还不清楚T-DNA整合是随机事件还是偏向于特定的基因组区域。整合的动力学仍然不清楚。通过高通量测序,我们与来自布鲁克林学院的Theodore Muth教授合作,发现T-DNA可以在感染后6小时内整合。此外,我们还证明了选择的转换事件和未选择的转换事件之间有很大的区别。选择的事件大多发生在基因丰富的区域,远离着丝粒和低甲基化和无核小体区域。未选择的事件发生在整个染色体,包括异染色质区域。