DNA克隆

近年来,ISPC采用了两种基于载体全质粒扩增和插入的独立连接克隆(LIC)策略:

  • 无限制(RF)克隆
  • Transfer-PCR (TPCR)

射频(van den Ent和Lowe昂格尔et al。法勒和昂格尔)及TPCR (Erijman等.,埃里克曼,希夫曼和法勒)程序是通用的克隆方法,允许将DNA片段精确地插入到圆形质粒的任何所需位置。这两种方法都是基于包含侧翼靶-载体特定序列的巨型引物(最多几个kbs)的合成。巨引物通过线性扩增反应在预先设计的位置整合到目的载体中。

射频克隆是一个两阶段的过程:

  • 巨引物的合成与纯化。
  • 将巨引物整合到目的载体中,生成新的包含感兴趣基因的重组载体。

TPCR是一个单管克隆反应,所有反应成分混合在一个管中。反应效率高度依赖于初始引物浓度(10-20 nM /引物)。

RF/TPCR方法被成功地用于各种应用,以操纵目标DNA序列。下图说明了一些此类应用程序。

射频/TPCR应用的示意图

RF和TPCR的优点

  • 任意选择的向量都可以使用
  • 载体和PCR产物无需酶切
  • 克隆可以在任何需要的位置执行
  • 不需要对受体向量(圆形向量)进行任何预处理
  • 不需要购买任何商业套件
  • 便宜快速-只需要耐热聚合酶(例如,来自NEB的Phusion, Q5)