DNA克隆

近年来,ISPC根据载体和插入物的全质粒扩增改编了两种结扎独立的克隆(LIC)策略:

  • 限制(RF)克隆
  • 转移-PCR(TPCR)

rf(van den ent和loweUnger等人。Peleg和unger.)和tpcr(Erijman等人。,Erijman,Shifman和Peleg)程序是通用克隆方法,允许将DNA片段精确插入圆形质粒内的任何所需位置。两种方法都基于含有侧翼靶载体特异性序列的兆引物(最多几kBs)的合成。在线性扩增反应中的预测位置,Mega-inders集成到目的地向量中。

RF克隆是一个两阶段的过程:

  • 兆引物的合成及纯化。
  • 将Mega-Primers集成到目的地向量中并生成包括感兴趣基因的新重组载体。

TPCR是单管克隆反应,其中所有反应组分在一个管中混合。反应的效率高度依赖于初始引物浓度(每个引物10-20nm)。

RF / TPCR方法在各种应用中成功使用以操纵靶DNA序列。下图说明了一些这样的应用。

RF / TPCR应用的示意图

RF和TPCR的优点

  • 可以使用任何选择的载体
  • 不需要限制酶消化载体和PCR产物
  • 可以在任何所需位置执行克隆
  • 在接受者矢量(圆形载体)的任何预处理中不需要
  • 无需购买任何商业套件
  • 廉价且快速 - 只需要热稳定的聚合酶(例如,羽毛,Q5来自NEB)